基因芯片技术的本质是（基因芯片技术）

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1、1 技术的基本步骤 1.1 基因芯片的制备 目前基因芯片的制备主要采用三种方法:即光蚀刻合成法，压电印刷法，点样法。

2、 1.1.1 光蚀刻合成法 是最初使用的一种方法，其主要过程是:在固相支持物上偶联带有可感光保护基团X的羟基，汞光有选择地照射到固相支持物，去掉可感光保护基团X,使羟基成为有功能的自由羟基，与加入的带X的核苷酸偶联，第一个反应物被嫁接到目标位置上。

3、随着反应的重复，链不断地延伸，当所需的寡核苷酸链合成完后，对反应基板进行无遮板的汞光普照，去除所有X，即可得到所多方面的寡核苷酸阵列。

4、这样，光照模式和反应物的加入顺序决定了合成产物的序列以及在基板上的位置。

5、该法可以合成30个碱基左右，其优点在于精确性高，缺点是制造可感光保护剂价格较高昂贵。

6、该法由美国的Affymetrix公司首先开发采用，目前该公司已开发成功能同时检测6500个已知人类基因的DNA芯片。

7、 1.1.2 电压印刷法 其原理类拟于喷墨打印机，打印机头上的墨盒有四个，分别装有四种不同的碱基，打印机头在方阵上移动，并将带有某种碱基的试剂滴到基板表面，然后固定，经过洗脱和去保护后，就可连上新的核苷酸，使寡核苷酸链延伸。

8、该法采用的技术原理与传统的DNA固相合成相一致。

9、压电印刷法可以合成40-50个碱基，此法效率高但工艺不太成熟，目前该法主要由美国的Incyte Pharmaceuticals公司采用。

10、 1.1.3 点样法 即预先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分离得到cDNA，再通过点样机直接将其点到芯片上。

11、寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通过多孔玻璃合成法。

12、肽核苷酸虽然在制备上比较复杂，但是它与DNA探针相比，由于PNA与DNA结合的复合物更加稳定和特异，因而更加有利于单碱基错配基因的检测。

13、严自某一细胞的cDNA必须进行预处理，纯化，扩增以及分类，然后再利用机械手把它们准确地固定在基板的相应位置上，为了保证cDNA芯片检测的准确性，在制备cDNA芯片以前必须提高低表达基因cDNA的丰度，降低高表达基因cDNA的丰度。

14、点样法的优点在于成本低、速度快，但缺点是构成方阵的寡核苷酸或cDNA片段需事先纯化。

15、目前采用该法的公司最多，有英国的Brax Genomics Limited公司，美国的Hyseq,Molecular Dynamics,Nanogen等多家公司。

16、 1.2 样品的制备 生物样品成分往往比较复杂，所以在与芯片接触前，必须对样品先进行处理。

17、为了提高结果的准确性，来自血液或组织中的DNA/mRNA样本须先行扩增，然后再被荧光素或同位素标记成为探针。

18、 1.3 杂交 影响杂交的因素很多，但主要是时间，温度及缓冲液的盐浓度。

19、如果是表达检测，需要长历时，低温和高盐条件的较严谨性杂交。

20、而如果是突变检测，需要短历时，高温和低盐条件高严谨性杂交。

21、总之，杂交条件的选择要根据芯片上核酸片段的长短及其本身的用途来定。

22、 1.4 杂交图谱的检测和读出 目前最为常用的是激光共聚焦荧光检测系统，其原理主要是与芯片发生杂交的探针上的荧光被激发后经过棱镜刚好能通过共聚集小孔，而能被探测器检测到，而芯片之外的其它荧光信号则不能被探测器检测到，检测到的荧光信号通过计算机处理后就可直接读出杂交图谱，此法灵敏度和精确度较高，但是扫描所需时间较长。

23、另一种检测系统采用CCD摄像原理，它虽然灵敏度和精确度较低，但所需的扫描时间较短，因而更适用于临床诊断。

24、此外，近年来还发展了多种检测方法，如质谱法，化学发光法，光导纤维法等多种方法，其中最有前途的是质谱法。

25、Taton等发明了一种新的芯片检测操作方案--Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probe,该法使用了Au和Ag两种金属离子来标记寡核苷酸探针，另外使用普通的平台扫描仪检测。

26、他们通过研究发现使用金属离子标记探针与基板进行杂交时，其退火温度曲线与使用传统的荧光标记探针的完全不同。

27、这种不同使得杂交时其单核苷酸错配的几率比传统的荧光标记探针法低3倍以上。

28、另外这种金属离子标记探针在与芯杂交时会互相交联形成一种较大颗粒的网络结构。

29、由于以上两个原因使用该法进行DNA芯片检测时其灵敏度比使用荧光标记法高两个数量级。

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